05月03 高鹽喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠腸道生態(tài)失調(diào)引發(fā)小鼠早期腎損傷
Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers?early renal injury induced by chronic high salt feeding?in mice
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發(fā)表雜志：Experimental & Molecular Medicine
影響因子：5.063
PMID：28857085
前言
高血壓的患病率不斷增加，正在成為世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題，但是高血壓的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚。 腎損傷和功能障礙可能是導(dǎo)致血壓升高的主要原因之一，一些證據(jù)表明 鹽攝取能夠上調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)并增加腎臟損傷，但高鹽（HS）攝入與腎損傷發(fā)展之間的關(guān)系尚不清楚。本文研究人員用HS水喂養(yǎng)小鼠持續(xù)8周，并研究由此產(chǎn)生的腸道病理生理變化及其對(duì)早期腎臟異常的影響。
材料和方法
使用6至8周齡的雄性特異性無(wú)病原體C57BL / 6小鼠。根據(jù)處理方法分為：對(duì)照組（飲用水），HS實(shí)驗(yàn)組（飲用水+ NaCl，8周），抗生素實(shí)驗(yàn)組（飲用水+ NaCl+多粘菌素B+新霉素，8周）。
分析內(nèi)容如下：1.微生物分析；2.組織分析；3.基因表達(dá)分析，RNA-Seq使用百邁客BioMarker Technologies（Beijing，China）Illumina HiSeq 2500平臺(tái)；4.蛋白質(zhì)表達(dá)和生化分析；5.FD-4滲透性實(shí)驗(yàn)；6.糞便微生物群移植（FMT）；7.統(tǒng)計(jì)分析
分析結(jié)果
1.慢性高鹽攝入導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)
首先，研究人員檢查HS攝入是否會(huì)影響腸道細(xì)菌。慢性HS喂養(yǎng)后，盲腸中的總細(xì)菌負(fù)荷略有下降，但無(wú)顯著變化（圖1a）。慢性HS喂養(yǎng)后，回腸上皮（圖1b）和結(jié)腸腔內(nèi)（圖1b）的細(xì)菌負(fù)荷也降低。慢性HS處理顯著降低厚壁菌門和提高擬桿菌的水平，這表明細(xì)菌組合物在HS攝入后發(fā)生改變。
圖1. 慢性高鹽喂養(yǎng)減少腸內(nèi)的細(xì)菌負(fù)荷
為了研究HS攝入如何影響腸道微環(huán)境，研究人員將HS組的細(xì)菌組成與對(duì)照組相比，在HS處理后，盲腸中Actinobacteria，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes在門水平和Actinobacteria以及Clostridia和Bacteroidia的百分比顯著不同。unweighted uniFrac分析結(jié)果顯示HS和對(duì)照組分別聚集（圖2b）。進(jìn)一步分析顯示，HS和對(duì)照組在回腸粘液層分別聚集（圖2c），而對(duì)照組和HS組形成兩個(gè)聚類，分離趨勢(shì)明顯在結(jié)腸粘液層（圖2d）。研究結(jié)果表明，慢性HS喂養(yǎng)可能導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)，細(xì)菌計(jì)數(shù)和微環(huán)境組成的變化也證明了這一點(diǎn)。
圖2. 慢性高鹽喂養(yǎng)引起腸道生態(tài)失調(diào)
2.慢性高鹽喂養(yǎng)導(dǎo)致消化道反應(yīng)受損的腸道異常
腸道生態(tài)失調(diào)通常與腸道病理生理學(xué)的改變有關(guān)，研究人員檢查了慢性HS喂養(yǎng)對(duì)腸道變化的影響。在對(duì)照組和HS-喂養(yǎng)組小鼠的回腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞形態(tài)沒有差異（圖3a）。此外，通過TUNEL和ki67染色鑒定的相似數(shù)量凋亡和增殖細(xì)胞表明，慢性HS喂養(yǎng)不影響腸道中的細(xì)胞死亡（圖3a）。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)炎癥標(biāo)志物表達(dá)被慢性HS攝入顯著改變。特別是，Ccl4，Ccl5和Ifn-γ在HS小鼠的回腸中表現(xiàn)出更高的mRNA水平（圖3b）。 IFN-γ免疫組織化學(xué)在回腸中的結(jié)果證實(shí)了基因表達(dá)數(shù)據(jù)（圖3c）。由于TLR家族蛋白和Nf-κB是參與病原體相關(guān)免疫應(yīng)答的主要分子，進(jìn)一步評(píng)估TLR家族和Nf-κB基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TLR2，TLR3和TLR5mRNA水平在回腸中趨于更高（圖3d）。同時(shí)，HS處理后IRF7，GATA3和NFKB2的表達(dá)顯著上調(diào)（圖3e）。此外，HS喂養(yǎng)后白細(xì)胞中CD38的表達(dá)在回腸中升高（圖3f）。然后通過RNA測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并比較涉及“細(xì)胞因子 – 細(xì)胞因子受體相互作用”，“ NF-κB信號(hào)通路“和”Toll樣受體信號(hào)通路“。在回腸和結(jié)腸中，兩組之間許多基因的表達(dá)是不同的?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明慢性HS攝入導(dǎo)致腸炎癥反應(yīng)中斷。
圖3. 慢性高鹽喂養(yǎng)與腸道炎癥反應(yīng)中斷有關(guān)
3.慢性高鹽攝入導(dǎo)致腸屏障功能喪失并促進(jìn)細(xì)菌易位進(jìn)入腎臟
腸道免疫反應(yīng)受損始終與腸道屏障功能障礙有關(guān)，研究人員研究了HS的攝入如何影響腸道屏障功能。HS攝入顯著降低了tjp-1，tjp-2，claudin-1，claudin-7和claudin-8基因的表達(dá)（圖4a）。 此外，與對(duì)照小鼠相比，HS攝入后，回腸和結(jié)腸中屏障形成的緊密連接ZO-1蛋白水平和結(jié)腸中的Occludin蛋白水平顯示出較低的趨勢(shì)（圖4c和d）。 另一方面，在HS喂養(yǎng)回腸和結(jié)腸后，成孔緊密連接蛋白Claudin-2蛋白水平顯著較高（圖4c和d）。這些數(shù)據(jù)清楚地表明腸道腸道屏障被慢性HS攝入所破壞。
腸道通透性增加可能導(dǎo)致腸道細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物易位至腸外組織。通過使用16s PCR來識(shí)別細(xì)菌DNA，檢測(cè)到腎臟，肝臟和脾臟中的細(xì)菌移位。有趣的是，慢性HS攝入特異性促進(jìn)了細(xì)菌移位進(jìn)入腎臟，但不能進(jìn)入肝臟或脾臟（圖4e）。進(jìn)一步分析了腎細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)與基于LEfSe測(cè)量的對(duì)照相比，屬于腸道細(xì)菌的桿菌被發(fā)現(xiàn)在HS處理的腎中富集（圖4f）。特別是，與對(duì)照動(dòng)物的腎臟相比，在HS喂養(yǎng)的腎臟中，芽孢桿菌和Planomicrobium的水平分別增加2.6倍和8.7倍。這些結(jié)果表明慢性HS攝入可以促進(jìn)某些細(xì)菌的易位。該數(shù)據(jù)清楚地表明HS喂養(yǎng)與腸道屏障破壞和腸道細(xì)菌易位進(jìn)入腎臟有關(guān)。
圖4. 慢性高鹽喂養(yǎng)導(dǎo)致腸道屏障功能障礙并促進(jìn)細(xì)菌移位進(jìn)入腎臟
4.慢性高鹽喂養(yǎng)相關(guān)的腸屏障破壞和腎損傷取決于腸道微生物群
為了進(jìn)一步闡明HS攝入后腸道生態(tài)失調(diào)和腎損傷之間的關(guān)系，給小鼠喂養(yǎng)多粘菌素B和新霉素?？股亟o藥確實(shí)恢復(fù)了HS飼喂誘導(dǎo)的回腸Ifn-γ過表達(dá)，通過糞便白蛋白和FD-4滲透監(jiān)測(cè)腸道泄漏，以及通過血漿內(nèi)毒素水平和腎臟16s / 18s比率監(jiān)測(cè)的細(xì)菌移位，通過尿和血漿Na +濃度測(cè)量，抗生素不改變鈉負(fù)荷（圖5a）。雖然8周HS喂養(yǎng)并未引起纖維化等進(jìn)展性腎損傷，但由col1a1 mRNA水平監(jiān)測(cè)（圖5b），HS喂養(yǎng)增加了血漿肌酐水平。更重要的是，與對(duì)照組小鼠相比，HS-喂養(yǎng)小鼠腎功能障礙的主要標(biāo)志物尿白蛋白/肌酐比率顯著增加，抗生素治療幾乎可以完全恢復(fù)腎功能（圖5d）。另外，TUNEL染色顯示抗生素施用可以降低HS誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞的升高（圖5e和f）?？傊?，該數(shù)據(jù)表明，抗生素治療能夠改善腸道滲漏和HS喂養(yǎng)引起的早期腎損傷。
圖5. 抗生素改善慢性高鹽喂養(yǎng)引起的早期腎損傷
5.慢性高鹽喂養(yǎng)引起的收縮壓升高取決于腸道微生物群
慢性HS喂養(yǎng)可能導(dǎo)致動(dòng)脈壓升高，并且研究人員還檢測(cè)到抗生素如何影響這種進(jìn)展。 如圖6所示，雖然HS處理的小鼠的DBP和平均血壓沒有增加，但是慢性HS喂養(yǎng)后SBP明顯升高。 有趣的是，抗生素治療能夠完全恢復(fù)海拔。 這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明慢性HS喂養(yǎng)引起的SBP升高取決于腸道微生物群。
圖6. 抗生素可以恢復(fù)慢性高鹽喂養(yǎng)引起的血壓升高
6.來自慢性高鹽處理的小鼠的腸道微生物群可以獨(dú)立地引起腸道泄漏和早期腎損傷
最后，為了進(jìn)一步證明腸道微生物群是腎損傷發(fā)展的上游因素，進(jìn)行了糞便微生物群移植實(shí)驗(yàn)。喂食正常飲食（不是高鹽）的兩組小鼠口服來自對(duì)照和HS處理的小鼠的糞便。8周后，接受對(duì)照糞便的對(duì)照小鼠的盲腸壁Firmicutes/Bacteroidetes比例（其是微生物群組成改變的主要標(biāo)志）顯著高于接受HS糞便的HS小鼠，其為 與研究人員之前的數(shù)據(jù)一致，表明HS喂養(yǎng)降低了盲腸中的Firmicutes / Bacteroidetes比例，并證明該糞便微生物群移植實(shí)驗(yàn)是成功的（圖7a）。此外，如圖7b和c所示，給藥后4周，由糞便白蛋白含量監(jiān)測(cè)的腸道通透性在接受HS喂養(yǎng)糞便的小鼠中顯著增加，并且重要的是，尿白蛋白/肌酸酐比率（目前研究中觀察到的腎功能障礙的主要表型）在移植后4周接受HS喂養(yǎng)的糞便的小鼠中也顯著增加。最后，與對(duì)照小鼠相比，HS糞便移植小鼠中腎臟凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（圖7d和e）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，HS喂養(yǎng)引起的腸道生態(tài)失調(diào)是腎損傷和功能障礙的原始誘因。
圖7. 腸道泄漏和腎損傷可通過腸道微生物群轉(zhuǎn)移
創(chuàng)新點(diǎn)
研究人員發(fā)現(xiàn)，暴露于飲食鹽的第一個(gè)器官是腸道，基于這一理論研究人員巧妙的研究鹽攝取是否能夠直接破壞腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，反過來引發(fā)早期腎臟損傷。研究結(jié)果顯示，8周的慢性HS喂養(yǎng)導(dǎo)致腎凋亡細(xì)胞數(shù)量增加和腎功能損傷增加，這種早期腎損害歸因于腸細(xì)菌易位至腎中。由于HS誘導(dǎo)的生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致腸道屏障喪失，發(fā)生易位。該發(fā)現(xiàn)為“腸 – 腎axis”提供了新的見解。目前，沒有證據(jù)表明病原體相關(guān)的分子模式來源于腸可以直接損傷腎臟。因此，該研究是對(duì)“腸 – 腎軸”理論的新增加，揭示了HS相關(guān)早期腎損傷發(fā)展的新型基礎(chǔ)發(fā)病機(jī)制
參考文獻(xiàn)
Hu J, Luo H, Wang J, et al. Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers early renal injury induced by chronic high salt feeding in mice.[J]. Experimental & Molecular Medicine, 2017, 49(8):e370.